超微量分光光度計常見的用途

分光光度計是一類很重要的分析儀器　，無論在物理學、化學、生物學、醫(yī)學、材料學、環(huán)境科學等科學研究領域　，還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門　，紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應用。分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

超微量分光光度計已成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈ＤＮＡ，以及ＲＮＡ。核酸的最高吸收峰的吸收波長２６０　ｎｍ。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：１ＯＤ　的吸光值分別相當于５０μｇ／ｍｌ的ｄｓＤＮＡ，３７μｇ／ｍｌ的ｓｓＤＮＡ，４０μｇ／ｍｌ的ＲＮＡ，３０μｇ／ｍｌ的Ｏｌｉｇ。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如德國伯赫Ｃｏｌｉｂｒｉ超微量分光光度計的準確度≤１．０％（１Ａ）。這樣多次測試的結(jié)果在均值１．０％左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的ｐＨ值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用ｐＨ值一定、離子濃度較低的緩沖液，如ＴＥ，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于０．１Ａ，吸光值最好在０．１－１．５Ａ。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如Ａ２６０／Ａ２８０的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是２８０ｎｍ。純凈的樣品，比值大于１．８（ＤＮＡ）或者２．０（ＲＮＡ）。如果比值低于１．８　或者２．０，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。Ａ２３０表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸Ａ２６０／Ａ２３０的比值大于２．０。Ａ３２０檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，Ａ３２０一般是０。

蛋白質(zhì)直接定量

這種方法是在２８０ｎｍ波長，直接測試蛋白。選擇Ｗａｒｂｕｒｇ　公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除３２０ｎｍ　的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求Ａ２８０的吸光值至少大于０．１Ａ，最佳的線性范圍在１．０－１．５　之間。實驗中選擇Ｗａｒｂｕｒｇ　公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察Ａ２８０的吸光值的變化范圍不超過１％，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Ｗａｒｂｕｒｇ　公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如ＤＮＡ的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質(zhì)定量

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關，從而反應蛋白質(zhì)濃度。

比色方法一般有ＢＣＡ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｌｏｗｒｙ　等幾種方法。

Ｌｏｗｒｙ　法：以最早期的Ｂｉｕｒｅｔ　反應為基礎，并有所改進。蛋白質(zhì)與Ｃｕ２　反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Ｂｉｕｒｅｔ　相比，Ｌｏｗｒｙ　法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含ＥＤＴＡ，Ｔｒｉｔｏｎ?。保埃?，ａｍｍｏｎｉａ?。螅酰欤妫幔簦濉〉任镔|(zhì)的蛋白不適合此種方法。

ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｎｅ?。幔悖椋洹。幔螅螅幔┓ǎ哼@是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Ｃｕ２　反應產(chǎn)生Ｃｕ　，后者與ＢＣＡ形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在５６２ｎｍ波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Ｌｏｗｒｙ法，操作簡單，敏感度高。但是與Ｌｏｗｒｙ法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

Ｂｒａｄｆｏｒｄ　法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰５９５ｎｍ。其最大的特點是，敏感度好，是Ｌｏｗｒｙ　和ＢＣＡ　兩種測試方法的２　倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩(wěn)定１小時，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Ｌｏｗｒｙ，ＢＣＡ　反應的還原劑（如ＤＴＴ，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。

某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Ｋｅｌｌｅｒ等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Ｌｏｗｒｙ，ＢＣＡ　測出的濃度明顯高于Ｂｒａｄｆｏｒｄ，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Ｌｏｗｒｙ測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以ＢＳＡ作標準品，濃度１．３４ｍｇ／ｍｌ，以ａ球蛋白作標準品，濃度２．６４ｍｇ／ｍｌ。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構(gòu)成，尋找化學構(gòu)成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后１０１１分光光度計的重要配件——　比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液ＰＨ值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。

ＯＤ?。叮埃?/p>

實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。ＯＤ６００是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的ＯＤ值出現(xiàn)負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細菌培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應，發(fā)生變色反應。另外，需注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態(tài)。

超微量分光光度計的主要結(jié)構(gòu)

各種型號的分光光度計基本結(jié)構(gòu)都相同，由如下五種部分組成：

１）光源（鎢燈、鹵鎢燈，氫弧燈，氘燈、氙燈或激光光源）；

２）單色器（濾光片、棱鏡、光柵、全息柵）；

３）樣品吸收池；

４）檢測系統(tǒng)（光電池、光電管、光電倍增管）；

５）信號指示系統(tǒng)（檢流計、微安表、數(shù)字電壓表、示波器、微處理機顯像管）。

光源－單色器－樣品吸收池－檢測系統(tǒng)－信號指示系統(tǒng)。

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