3年經(jīng)驗總結(jié)！新冠檢測實驗室，核酸氣溶膠污染避坑指南！
發(fā)布時間：2022-11-17 09:06:13
核酸檢測實驗室想完全杜絕核酸污染是不可能的。核酸檢測實驗室的管理者和實驗人員必須要認(rèn)識到核酸污染是不可避免的，但是污染的頻率和概率是可控的。我們要做的是時刻保持警惕，盡最大努力將污染的概率降到最低，并且能第一時間發(fā)現(xiàn)污染并及時進行處理。
當(dāng)?shù)貢r間２０２０年４月１８日，《華盛頓郵報》（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｐｏｓｔ）爆了一則重磅新聞，美國ＣＤＣ在實驗室生產(chǎn)的新冠病毒檢測試劑出現(xiàn)了污染問題，導(dǎo)致全美的核酸檢測推遲最少一個月。１月２１日，ＣＤＣ已經(jīng)“確定開發(fā)”了新冠病毒的檢測方法，并使用它來確認(rèn)美國的第一例新冠病例，１月下旬，美國ＣＤＣ對２６個公共衛(wèi)生實驗室發(fā)放新冠病毒試劑盒，有２４個實驗室出現(xiàn)了假陽性反應(yīng)。ＣＤＣ緊急召回了診斷試劑，直到３月２日，ＣＤＣ的新冠病毒試劑由Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ?。模危痢。裕澹悖瑁睿铮欤铮纾椋澹?，ＩＤＴ公司生產(chǎn)重新投入使用。這起實驗室污染的代價是美國錯過了黃金的疫情防控窗口，數(shù)萬甚至數(shù)十萬普通民眾死亡。每一個實驗室都應(yīng)該把這個教訓(xùn)銘記在心，時刻提醒自己，核酸污染隨時都可能發(fā)生，無論什么級別的實驗室都可能發(fā)生。較常見，發(fā)生概率在４０％～６０％之間；以重組質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控品，發(fā)生污染的概率更大；以構(gòu)建的假病毒或重組病毒作為陽性質(zhì)控品，參與核酸提取的過程中，也容易發(fā)生氣溶膠污染；在試劑的配制過程中，接觸了污染的容器、移液器、槍頭、溶液，核酸氣溶膠等，導(dǎo)致試劑被污染。筆者認(rèn)為，這是目前實驗室引起的核酸污染最主要原因！尤其是是第一代ＰＣＲ技術(shù)，發(fā)生概率在６０％以上；ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)反復(fù)多次的擴增，其復(fù)制量遠遠超過ＰＣＲ的檢測極限。
一個氣溶膠所包含的拷貝數(shù)可以在１０４～１０６ｃｏｐｉｅｓ，因此即使是極微量的污染也足以造成實驗結(jié)果假陽性。
但是，在采用了ＵＮＧ／ＵＤＧ防污染的ＰＣＲ產(chǎn)品中，擴增產(chǎn)物引起的污染概率降至１０％左右。
ＰＣＲ擴增管的密封性是預(yù)防擴增產(chǎn)物污染的關(guān)鍵。如果密封不嚴(yán)，擴增完成后有蒸發(fā)現(xiàn)象，液面不整齊，或者擴增過程中有“炸管”聲音。
放置樣品的容器被污染或由于容器密封不嚴(yán)導(dǎo)致樣品與外界接觸被污染；待提取樣本中含有強陽性樣本，其提取的樣品中含有高濃度的陽性核酸，形成氣溶膠造成污染。氣溶膠是由空氣與液體表面摩擦而產(chǎn)生的。開蓋、晃動、加樣器的反復(fù)抽吸等開放式操作，形成核酸氣溶膠從而導(dǎo)致核酸污染。以上核酸污染來源，均可形成氣溶膠擴散至空氣中，或直接吸附到物體表面。因此，應(yīng)尤其重視由氣溶膠導(dǎo)致污染的問題。重度污染假陽性的ｃｔ值可在２４左右，中度污染ｃｔ值在３０左右；輕度污染ｃｔ值在３３左右。１、空氣中的核酸氣溶膠污染物：彌散到實驗室各個角落，比較棘手；２、物表的核酸污染物：移液器、離心機、核酸提取儀、傳遞窗、ＰＣＲ儀、拆開的試劑盒、槍頭盒、打開的耗材等表面。嚴(yán)格的ＰＣＲ實驗室應(yīng)有標(biāo)準(zhǔn)的正負壓系統(tǒng)及四分區(qū)（或三分區(qū)），實驗室應(yīng)按照生物安全二級實驗室及ＰＣＲ實驗室設(shè)計基本要求來建設(shè)?？蓞⒖嫉臉?biāo)準(zhǔn)為《ＧＢ５０３４６－２０１１建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》及衛(wèi)健委下發(fā)的《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》。醫(yī)療口的實驗室大多符合要求，在科研口和農(nóng)業(yè)口的實驗室應(yīng)重視實驗室的規(guī)范性建設(shè)！軟件配置應(yīng)按照衛(wèi)健委相關(guān)技術(shù)文件規(guī)定，人員配置應(yīng)專區(qū)專人，人員不可不同分區(qū)混用，物流、人流、氣流做到單向流動！臨床上，門診的新冠快檢ＰＣＲ實驗室（或免提取方法）多半不規(guī)范。沒有嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)ＰＣＲ實驗室建設(shè)，更加容易發(fā)生污染。三分區(qū)（或二分區(qū)）、緩沖間、正負壓、人員配置２人以上，這些基本要求沒有達到，更加容易發(fā)生氣溶膠污染。現(xiàn)有技術(shù)指導(dǎo)原則，只要求了選擇ＢＳＬ－Ⅱ級生物安全柜，但并未規(guī)定具體型號。從臨床經(jīng)驗來看，只有Ｂ２型生物安全柜可以用于加核酸模板。Ａ１型、Ａ２型、Ｂ１型，循環(huán)風(fēng)很容易造成核酸氣溶膠的形成，從而造成污染，且污染很難清除。Ｂ２型為全排放，無循環(huán)風(fēng)，可以用于加核酸模板。
紫外燈能殺滅病毒，但是《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》指出，短片段的基因核酸對紫外線損傷不敏感。常規(guī)消毒劑如酒精、碘化物、戊二醛類、季銨鹽等雖然能殺菌，但是不能降解核酸，或降解效率較差。尤其是酒精，它其實是核酸提取試劑中的一個組分，對核酸沒有任何降解作用。已知的消毒劑中，次氯酸鹽類消毒劑可以一定程度的降解核酸，但是腐蝕性強，不能處理精密儀器及金屬制品，容易腐蝕移液器吸桿影響ｔｉｐ頭氣密性。吸取陽性對照（質(zhì)粒）沒有遵循“慢吸快打”的原則（這個需要練習(xí)形成“肌肉記憶”），新手往往是“快吸快打”，造成陽性樣品污染槍頭，或者在生物安全柜循環(huán)風(fēng)的影響下，造成氣溶膠飛濺，污染加樣區(qū)域。應(yīng)使用帶有濾芯的槍頭。
帶濾芯槍頭
４．２ 加樣區(qū)沒有放置臺面垃圾桶：應(yīng)把加完樣的ｔｉｐ槍頭，丟入含有次氯酸溶液的加蓋垃圾桶中。因為次氯酸容易揮發(fā)，因此應(yīng)每天都要更換含氯消毒液！
桌面垃圾桶（利器盒）
在筆者的臨床實踐中，發(fā)現(xiàn)以下區(qū)域存在陽性污染的概率更大：
生物安全柜＞核酸提取儀＞移液器＞ＰＣＲ擴增儀（ＰＣＲ管密封性）＞離心機；陽性質(zhì)控品＞強陽性樣本＞ＰＣＲ擴增產(chǎn)物（無ＵＮＧ技術(shù)）＞ＰＣＲ擴增產(chǎn)物（ＵＮＧ技術(shù)），ＰＣＲ管密封性是擴增產(chǎn)物是否引起污染的關(guān)鍵。如同，幸福的家庭都一樣，不幸的家庭各有各的不幸。同理，規(guī)范的實驗室都一樣，污染的實驗室各有各染情況。以上數(shù)據(jù)僅供參考。核酸檢測實驗室的布局是預(yù)防污染的根本，合理布局可以大大降低污染的概率。一般情況分為四個區(qū)分別為試劑準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。對于不需要電泳的熒光定量ＰＣＲ，核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可以合并。每個區(qū)應(yīng)獨立通風(fēng)，可控制空氣流動方向。有些核酸檢測實驗室在實驗室建設(shè)時未考慮到核酸擴增需求，就是按照普通實驗室建設(shè)。這種情況下，個人建議擴增和產(chǎn)物分析區(qū)應(yīng)遠離試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)，盡量不在一個樓層或者不在一個區(qū)域。最忌諱的是幾個實驗室緊挨著，甚至門對門。另外建議廢棄物處理的房間也要遠離以上實驗室，避免廢棄物處理過程中產(chǎn)生的污染。四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標(biāo)記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服，以便于鑒別。進入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)（簡稱擴增區(qū)）至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。再好的實驗室設(shè)計，如果實驗人員不遵守規(guī)程，一切都是徒勞的。加強實驗室人員的培訓(xùn)和管理至關(guān)重要。陰性質(zhì)控：實驗室的核酸污染風(fēng)險跟檢測量正相關(guān)，因此在檢測活動比較頻繁時需要多添加陰性質(zhì)控，包括陰性樣品，陰性提取對照，陰性擴增對照，無模板對照，甚至可以使用反應(yīng)體系，引物探針和提取試劑等作為對照以檢驗檢測流程和反應(yīng)系統(tǒng)組分的污染。陰性對照可以使用幾個隨機插入檢測樣品。保證出現(xiàn)污染可以第一時間發(fā)現(xiàn)。陽性質(zhì)控：避免或減少使用過強的質(zhì)粒陽性對照。有一些規(guī)范建議ＰＣＲ產(chǎn)物使用１ｍｏｌ／Ｌ鹽酸浸泡，我認(rèn)為這極易造成ＰＣＲ產(chǎn)物的暴露和擴散，具有很高的風(fēng)險。還有一些實驗室從生物安全的角度將所有的實驗廢棄物全部高壓，我也是不建議的，因為ＰＣＲ產(chǎn)物沒有生物安全風(fēng)險，高壓會造成ＰＣＲ產(chǎn)物擴散，對實驗室的污染風(fēng)險更高。個人建議對于ＰＣＲ產(chǎn)物，進行表面消毒后按照普通醫(yī)療廢棄物處理即可。對于一般的核酸檢測實驗室，推薦使用封閉擴增的熒光定量ＰＣＲ方法進行核酸檢測。不推薦使用普通ＰＣＲ方法和巢氏ＰＣＲ，使用這兩種方法實驗室污染是大概率事件。謹(jǐn)慎使用等溫擴增的方法，等溫擴增的酶反應(yīng)效率更高，產(chǎn)物中模板含量也更高，污染的概率也會提高。操作核酸時動作要輕柔，移液器吸液慢吸慢放，開管蓋要慢慢開，避免操作產(chǎn)生氣溶膠。使用渦動混勻后，稍稍靜置一會再開管蓋，推薦使用移液器緩慢吹吸混勻。其原理是用ｄＵＴＰ 代替ｄＴＴＰ，使產(chǎn)物中摻入大量ｄＵ。在再次進行ＰＣＲ 擴增前，用ＵＮＧ 處理ＰＣＲ 混合液即可消除ＰＣＲ 產(chǎn)物的殘留污染。由于ＵＮＧ 在ＰＣＲ 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含ｄＵ 的新的ＰＣＲ 產(chǎn)物。所有試驗物品盡可能分裝成小包裝：耗材開包后分裝成一周使用量，用自封袋封好。試劑也盡可能購買小包裝或者回實驗室分裝，實驗中經(jīng)常用到配液的水尤其需要分裝。實驗中所有吸頭都應(yīng)使用帶濾芯的吸頭。發(fā)現(xiàn)污染第一步就是要暫停實驗，評估假陽性對以往檢測結(jié)果的影響。對實驗進行徹底打掃和清理，盡可能更換相關(guān)的試劑耗材，對儀器設(shè)備進行清潔和去核酸處理。所有人員回家洗澡換衣服。使用商品化的ＤＮＡ去除劑，有好用的ＤＮＡ去除劑大家可以推薦給我１ ｍｏｌ／ｌ的 鹽酸和各種化學(xué)物質(zhì)去降解ＤＮＡ。停下所有實驗，靠風(fēng)和時間抹掉核酸的痕跡。這是我最常用的方法，通風(fēng)是最有效的方式。如果是擴增產(chǎn)物污染，在不去除污染的情況下仍然可以進行檢測。方法是使用另一種方法或試劑盒，只要兩種試劑的擴增產(chǎn)物不一致，沒有交叉反應(yīng)，仍然可以繼續(xù)試驗。但是這種方法要進行測試，我并不推薦這么做。移液器內(nèi)部被污染很難去除，可以通過清洗或者另換一套移液器。移除內(nèi)部所有物品，用ＤＮＡ去除劑擦拭表面后，打開柜門連續(xù)運行。用ＤＮＡ去除劑擦拭內(nèi)表面后，打開提取儀門或外罩，靜置。如果能及時發(fā)現(xiàn)污染，通常情況不會太嚴(yán)重，采取上述措施實驗室空置幾天污染會消除。但是如果發(fā)生了很嚴(yán)重的污染，采取上述措施污染仍不能消除，就只能把一切交給時間了。
（文章來源于互聯(lián)網(wǎng)）
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